Forscher haben eine neue Anwendung der Kryo‑EM entwickelt, die es ermöglicht, hochauflösende Strukturen von zellulären Makromolekülen direkt aus Zelllysaten zu bestimmen. Die Methode, die als In‑Extracto‑Kryo‑EM bezeichnet wird, kombiniert die Flexibilität von Einzelpartikel‑Kryo‑EM mit der Komplexität von in‑situ‑Ansätzen und liefert dabei Karten mit einer Auflösung von etwa 2,2 Å des mammalischen translationalen Apparats.
Methodik des In‑Extracto‑Cryo‑EM
Die Vorgehensweise beruht auf der Vorbereitung von zellulären Lysaten, die anschließend unmittelbar für die Kryo‑EM‑Analyse eingefroren werden. Durch den Verzicht auf umfangreiche Aufbereitungsschritte wird die native Zusammensetzung der Proben weitgehend erhalten, während gleichzeitig die hohen Auflösungsansprüche der Einzelpartikel‑Kryo‑EM erfüllt werden.
Auflösung und Template‑Matching
Ein zentrales Element der Analyse ist das zweidimensionale Vorlagen‑Matching (2DTM), das es ermöglicht, einzelne Ribosomen in den Aufnahmen zu identifizieren und zu klassifizieren. Mit dieser Technik konnten die Forscher Karten mit einer Auflösung von rund 2,2 Å erzeugen, was die Sichtbarkeit einzelner Aminosäurereste und kleiner Liganden erlaubt.
Ribosomen‑Abundanz in verschiedenen Lysaten
Untersuchungen von Lysaten aus primären Zelllinien (MCF‑7 und BSC‑1) sowie aus Kaninchen‑Retikulozyten zeigten, dass der Anteil elongierender Ribosomen stark variiert – von etwa 70 % in den menschlichen Zelllinien bis zu rund 10 % in den Retikulozyten. Diese Unterschiede spiegeln unterschiedliche translational‑Stress‑Reaktionen wider.
Hibernierende Ribosomen und assoziierte Faktoren
Ein Großteil der nicht‑translatierenden Ribosomen zeigte keine gebundene mRNA und war stattdessen mit einer Vielzahl von Proteinen besetzt, die die funktionellen Zentren des Ribosoms schützen. Das am häufigsten vorkommende Hibernations‑Protein war Elongationsfaktor 2 (eEF2), der an über 95 % aller 80S‑Ribosomen und überraschenderweise auch an 60S‑Untereinheiten gebunden war.
Bedeutung von eEF2 in der Hibernation
eEF2 bindet in seiner GDP‑Form an die Sarcin‑Ricin‑Schleife und das Protein uL14, wodurch es stabilisiert wird. Diese Interaktion verhindert die Weitergabe von Translokations‑Schritten und trägt zur Aufrechterhaltung des ruhenden Zustands der Ribosomen bei.
Implikationen für die Forschung
Die Ergebnisse demonstrieren, dass In‑Extracto‑Kryo‑EM ein effizientes Werkzeug ist, um native zelluläre Komplexe und deren funktionelle Zustände nahezu auf atomarer Ebene zu untersuchen. Die Methode eröffnet neue Möglichkeiten, die Vielfalt von Ribosomen‑Hibernations‑Strategien zu erforschen und könnte künftig zur Aufklärung weiterer zellulärer Prozesse eingesetzt werden.
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