USA: Thermostabile T7‑RNA‑Polymerase reduziert dsRNA‑Bildung
Forscher haben eine Variante des Bakteriophagen‑Enzyms T7‑RNA‑Polymerase entwickelt, die bei 48 °C aktiv bleibt und kaum doppelsträngliche RNA (dsRNA) erzeugt. Die Ergebnisse wurden in einer Open‑Access‑Studie veröffentlicht.
Hintergrund und Problemstellung
T7‑RNA‑Polymerase ist ein zentrales Werkzeug für die in‑vitro‑Transkription von synthetischer mRNA, die in Forschung und Therapie eingesetzt wird. Während des Transkriptionsprozesses entsteht jedoch häufig dsRNA, das das angeborene Immunsystem aktivieren und die Qualität des mRNA‑Produkts mindern kann.
Methodik
Die Wissenschaftler nutzten den Protein Repair One Stop Shop (PROSS) Web‑Server und vier Kristallstrukturen des Enzyms – einen Promotor‑Komplex, einen Initiations‑Komplex und zwei Elongations‑Komplexe – für unabhängige Designläufe. Mutationen, die in allen vier Entwürfen vorkamen, wurden zu Multi‑Structure PROSS Combined Designs (PCDs) zusammengefasst.
Ergebnisse
Der kombinierte Entwurf PCD9 behielt die volle Transkriptionsaktivität bis zu einer Temperatur von 48 °C, während das Wildtyp‑Enzym unter denselben Pufferbedingungen stark an Aktivität verlor. In einem Dot‑Blot‑Assay zeigte PCD9 bei 48 °C keinerlei nachweisbare dsRNA‑Signale, wohingegen das Wildtyp‑Enzym bereits bei 37 °C starke dsRNA‑Signale erzeugte und bei 48 °C keine RNA mehr synthetisierte.
Weitere Varianten
Zusätzliche PROSS‑Varianten, die ausschließlich auf der Elongations‑Komplex‑Struktur basierten, waren sowohl bei 37 °C als auch bei 48 °C inaktiv.
Bedeutung der Befunde
Die Studie demonstriert, dass ein Design, das mehrere strukturelle Zustände berücksichtigt, zu einer thermotoleranten T7‑RNA‑Polymerase führen kann, die bei erhöhten Temperaturen effizient arbeitet und die Bildung von dsRNA‑By‑Produkten reduziert.
Ausblick
Die Autoren schlagen vor, dass die Multi‑Structure‑Strategie auf andere dynamische Enzyme übertragen werden könnte, um deren Stabilität und Leistungsfähigkeit zu verbessern.
Dieser Bericht basiert auf Informationen von PLOS ONE, lizenziert unter Creative Commons BY 4.0 (Open Access). Wissenschaftliche Inhalte, offen zugänglich.
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